地黄块根膨大发生和驱动的组织观察及激素相关基因的调控分析(1)
[摘要] 目的：为了研究地黄块根膨大的发育特征，揭示激素相关基因在这个过程中的调控作用机制。方法：该研究以地黄品种“温-85”为实验材料，采集不同发育时期的地黄块根进行表型观察，利用半薄树脂切片技术观察块根的组织形态。从地黄转录组数据库中挑选与激素合成和响应相关的基因，利用qRT-PCR技术研究激素相关基因在地黄不同发育时期块根组织中的表达变化。结果：地黄的发育阶段可划分为苗期、拉线期、块根膨大初期，膨大中期，膨大后期和成熟期。块根解剖学特征分析表明次生形成层的分裂启动了地黄块根膨大的进程；膨大前期次生形成层的持续快速分裂和副形成层的形成驱动了块根的向外(平周)和侧向(圆周)持续快速膨大。在半薄和超薄切片观察过程中发现在地黄块根中存在有大量的油脂细胞。定量结果分析显示IAA，CK，ABA，乙烯，JA，EB的合成和响应基因整体呈现上调表达趋势，GA的合成与响应基因呈下调趋势，其负调控因子基因则上调表达。大部分激素合成相关基因的表达高峰期处在拉线期、膨大前期。结论：拉线期和块根膨大前期是地黄块根发育最为关键的时期，IAA，CK，ABA，乙烯，JA，EB的合成和响应基因的上调与GA合成基因的下调能促进块根的发育。油脂细胞可能与地黄药用成分的合成与储存有密切关系。该研究为阐述地黄块根发育的规律和分子调控机制进行了有益的探索。
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[关键词]地黄；块根发育；切片；激素；基因表达
地黄Rehmannia glutinosa L.是玄参科地黄属多年生草本植物，以干燥块根入药，是我国传统的大宗道地中药材，在我国有着悠久的栽培历史和辽阔的种植面积。地黄能够清热生津、滋阴补血，并具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老及降血糖等多方面功效，在临床上有广泛的应用[1]。地黄的药用形式有3种，即生地黄、干地黄和熟地黄，虽然药用形式多样，但是其药用的核心部位都是地黄的块根。因此，地黄块根能否正常发育膨大直接决定地黄的产量和品质。
目前，关于地黄的研究大多都集中在其药用成分的开发与应用上，对地黄块根发育机制的研究则相对较少，因此，研究地黄块根发育的形态特征和分子机制显的尤为重要。研究表明，激素在调控块根形成过程中具有重要作用[2-4]。在研究马铃薯和甘薯的块根发育过程中发现：细胞分裂素(CK)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ethylene)、茉莉酸(JA)等均能促进块根(块茎)的膨大，而赤霉素(GA)则抑制块根(块茎)的膨大[5-6]。激素在地黄块根的形成过程中也具有重要作用，例如薛建平等利用离体培养的方法研究了4 种激素在块根发育过程中的变化，结果表明IAA，GA，ABA，JA含量随着地黄块根发育呈逐渐上升趋势[7]。李先恩等通过分析栽培地黄和野生地黄块根中激素含量的差异，发现地黄块根的形成与发育是多种内源激素协同作用的结果[8]。虽然激素在地黄块根的发育过程中扮演着重要角色，然而激素合成与响应相关基因的分子调控机制还不清楚。
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为了阐述地黄块根膨大过程的发育特征，揭示激素相关基因在此过程中的分子调控作用机制，本研究以地黄块根为实验材料，依据块根不同发育时期的表性特征，利用半薄和超薄切片技术观察地黄不同发育时期的块根组织形态。依据前期构建的地黄转录组数据，挑选激素合成和响应的相关基因，利用qRT-PCR方法详细研究块根发育过程中激素相关基因的表达变化，为揭示地黄块根发育过程中的分子调控机制和发育机制研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 地黄
以广泛种植的地黄品种“温85-5”为实验材料，在地黄道地产区温县选择试验田种植。4月中旬以种栽种植，地黄出苗后每隔20 d定期取样，持续至地黄成熟(10月份)。将采集的地黄块根，水洗，拍照，液氮速冻，-80 ℃保存。
1.2 块根发育组织解剖学观察
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采用树脂半薄切片技术观察地黄块根组织形态[9]。将采集的块根洗净切段后，迅速放入FAA固定液，4 ℃，12 h，饿酸(1%)再固定，4 ℃，12 h ，乙醇梯度脱水和丙酮透明后，Epon-812树脂渗透与包埋，半薄切片机切片(1 μm)，甲苯胺蓝染色，光学显微镜观察。
透射电镜观察油脂细胞的超微结构，将已包埋固定的组织材料，超薄切片机切片(70 nm)，醋酸双氧铀染色，透射电镜下观察拍照。
1.3 激素合成响应相关基因的获取
根据前期构建的地黄转录组文库(NCBI SRA：SRX269425，SRX169426)的注释信息，采用以下原则挑选激素合成和响应相关的关键基因：根和叶中具有较高的表达丰度；Nr，GO，KEGG和SWISS-prot具有一致的注释信息；NR注释的同源性达到90%以上。
, http://www.100md.com 1.4 RNA的提取与反转录
按TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)说明书提取各发育时期样品的总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳(180 V，30 min )检测RNA质量，在260 nm/280 nm波长下测定总RNA的吸光度，计算其浓度。根据RT-PCR反转录试剂盒：RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，美国)合成cDNA。
1.5 qRT-PCR表达分析
各cDNA样品分别用筛选基因和内参基因进行定量PCR，每个反应重复3次，各基因和内参基因的引物序列见表1。反应体系为：SYBR Green PCR Mix(2×)10 μL，cDNA 1 μL， 正向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL，Free RNase H2O 8.2 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s， 59 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s进行40个循环；溶解曲线检测条件95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，然后以0.5 ℃·s-1的速度提高到95 ℃，连续检测荧光信号。基因的表达量以参照基因18S(DQ469606)为标准进行相对定量分析，相对表达量的计算方法采用2-ΔΔCt法[10]，以苗期根为对照，其Ct的平均数设为l，进行基因表达分析。, http://www.100md.com(王鹏飞 李鑫宇 李明杰 刘林 王潇然 王丰青 李春奇 陈新建 张重义)
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[关键词]地黄；块根发育；切片；激素；基因表达
地黄Rehmannia glutinosa L.是玄参科地黄属多年生草本植物，以干燥块根入药，是我国传统的大宗道地中药材，在我国有着悠久的栽培历史和辽阔的种植面积。地黄能够清热生津、滋阴补血，并具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老及降血糖等多方面功效，在临床上有广泛的应用[1]。地黄的药用形式有3种，即生地黄、干地黄和熟地黄，虽然药用形式多样，但是其药用的核心部位都是地黄的块根。因此，地黄块根能否正常发育膨大直接决定地黄的产量和品质。
目前，关于地黄的研究大多都集中在其药用成分的开发与应用上，对地黄块根发育机制的研究则相对较少，因此，研究地黄块根发育的形态特征和分子机制显的尤为重要。研究表明，激素在调控块根形成过程中具有重要作用[2-4]。在研究马铃薯和甘薯的块根发育过程中发现：细胞分裂素(CK)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ethylene)、茉莉酸(JA)等均能促进块根(块茎)的膨大，而赤霉素(GA)则抑制块根(块茎)的膨大[5-6]。激素在地黄块根的形成过程中也具有重要作用，例如薛建平等利用离体培养的方法研究了4 种激素在块根发育过程中的变化，结果表明IAA，GA，ABA，JA含量随着地黄块根发育呈逐渐上升趋势[7]。李先恩等通过分析栽培地黄和野生地黄块根中激素含量的差异，发现地黄块根的形成与发育是多种内源激素协同作用的结果[8]。虽然激素在地黄块根的发育过程中扮演着重要角色，然而激素合成与响应相关基因的分子调控机制还不清楚。
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为了阐述地黄块根膨大过程的发育特征，揭示激素相关基因在此过程中的分子调控作用机制，本研究以地黄块根为实验材料，依据块根不同发育时期的表性特征，利用半薄和超薄切片技术观察地黄不同发育时期的块根组织形态。依据前期构建的地黄转录组数据，挑选激素合成和响应的相关基因，利用qRT-PCR方法详细研究块根发育过程中激素相关基因的表达变化，为揭示地黄块根发育过程中的分子调控机制和发育机制研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 地黄
以广泛种植的地黄品种“温85-5”为实验材料，在地黄道地产区温县选择试验田种植。4月中旬以种栽种植，地黄出苗后每隔20 d定期取样，持续至地黄成熟(10月份)。将采集的地黄块根，水洗，拍照，液氮速冻，-80 ℃保存。
1.2 块根发育组织解剖学观察
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采用树脂半薄切片技术观察地黄块根组织形态[9]。将采集的块根洗净切段后，迅速放入FAA固定液，4 ℃，12 h，饿酸(1%)再固定，4 ℃，12 h ，乙醇梯度脱水和丙酮透明后，Epon-812树脂渗透与包埋，半薄切片机切片(1 μm)，甲苯胺蓝染色，光学显微镜观察。
透射电镜观察油脂细胞的超微结构，将已包埋固定的组织材料，超薄切片机切片(70 nm)，醋酸双氧铀染色，透射电镜下观察拍照。
1.3 激素合成响应相关基因的获取
根据前期构建的地黄转录组文库(NCBI SRA：SRX269425，SRX169426)的注释信息，采用以下原则挑选激素合成和响应相关的关键基因：根和叶中具有较高的表达丰度；Nr，GO，KEGG和SWISS-prot具有一致的注释信息；NR注释的同源性达到90%以上。
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按TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)说明书提取各发育时期样品的总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳(180 V，30 min )检测RNA质量，在260 nm/280 nm波长下测定总RNA的吸光度，计算其浓度。根据RT-PCR反转录试剂盒：RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，美国)合成cDNA。
1.5 qRT-PCR表达分析
各cDNA样品分别用筛选基因和内参基因进行定量PCR，每个反应重复3次，各基因和内参基因的引物序列见表1。反应体系为：SYBR Green PCR Mix(2×)10 μL，cDNA 1 μL， 正向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL，Free RNase H2O 8.2 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s， 59 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s进行40个循环；溶解曲线检测条件95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，然后以0.5 ℃·s-1的速度提高到95 ℃，连续检测荧光信号。基因的表达量以参照基因18S(DQ469606)为标准进行相对定量分析，相对表达量的计算方法采用2-ΔΔCt法[10]，以苗期根为对照，其Ct的平均数设为l，进行基因表达分析。, http://www.100md.com(王鹏飞 李鑫宇 李明杰 刘林 王潇然 王丰青 李春奇 陈新建 张重义)